Научному и медицинскому сообществу давно известны хромосомные аномалии, которые являются причиной врожденных пороков развития, бесплодия, умственной отсталости, задержки психомоторного развития и других форм интеллектуальных нарушений. Несмотря на распространенность и разнообразие хромосомных аномалий у пациентов, в настоящее время не существует способов эффективного лечения хромосомных заболеваний, а методы диагностики не всегда точны. Поэтому сибирские ученые занялись изучением спонтанной хромосомной нестабильности у пациентов с кольцевыми хромосомами в плюрипотентных стволовых клетках, создав удобный модельный объект для исследования процесса формирования хромосомных патологий в ходе индивидуального развития организма. Итоги пятилетней работы опубликованы в журнале Scientific Reports.
Научный сотрудник лаборатории цитогенетики НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ кандидат биологических наук Татьяна Никитина
Сегодня мы знаем о наличии наследственных заболеваний, локально поражающих определенный орган человека, которые потенциально можно вылечить посредством генотерапевтического внесения изменения в геном клетки соответствующей поврежденной системы. Но есть более тяжелые варианты мутаций, к которым относятся хромосомные перестройки, затрагивающие одновременно большое число генов. В таком случае практически невозможно провести коррекцию каждого отдельного гена в терапевтических целях. Единственным способом остается их профилактика с помощью методов пренатальной (дородовой), а в последнее время и преимплантационной генетической диагностики, проводимой в ходе процедуры искусственного оплодотворения, то есть еще до наступления беременности. Особенностью некоторых типов хромосомных аномалий является их нестабильность, то есть способность изменяться и индуцировать новые типы хромосомных мутаций в ходе клеточных делений. Такие вторичные мутации могут быть распределены непредсказуемым образом в различных тканях и органах пациента, как правило, недоступных для цитогенетического исследования, что, безусловно, затрудняет точную постановку диагноза, а в случае пренатальной диагностики вполне может стать причиной диагностической ошибки.
«Изначально идея работы базировалась на развитии технологии редактирования генома, удостоенной в прошлом году Нобелевской премии. Мы с коллегами решили проверить, возможно ли данный метод применить к исправлению более крупных дефектов, связанных не только с мутациями в отдельных генах, но и с хромосомными перестройками. Наше внимание привлекли кольцевые хромосомы, материал которых представлен в виде кольцевой, а не линейной (что обычно является нормой в генетике) молекулы. Для человека подобное явление достаточно редкое (один случай на пятьдесят тысяч новорожденных). В нашем организме всего 23 пары хромосом, и любая может образовать кольцевую структуру с потерями концевых участков, что приведет к риску формирования хромосомных болезней разной степени тяжести, — рассказывает врио директора Научно-исследовательского института медицинской генетики Томского национального исследовательского медицинского центра РАН доктор биологических наук, профессор РАН Игорь Николаевич Лебедев. — Второй технологией, подтолкнувшей нас к проведению исследования, является метод перепрограммирования — перевода дифференцированной клетки в исходное плюрипотентное состояние, свойственное эмбриональным стволовым клеткам на самых ранних этапах развития организма. Взяв фибробласты кожи пациента, мы можем вернуть их в исходное эмбриональное состояние и дальше, дифференцируя их в тот или иной специализированный тип клеток (например, нейроны, клетки сердечной мускулатуры или печени), детально проследить судьбу хромосомных мутаций».
У выбранных учеными двух методов есть один объединяющий момент. В работах нобелевского лауреата Шинья Яманаки было показано, что клетки с кольцевой хромосомой после перепрограммирования часто оказываются весьма нестабильными. Эволюционно организованные линейные хромосомы в процессе деления клетки распределяются иначе, поэтому кольцевая хромосома может просто потеряться. В результате этого в клетке вместо одной нормальной и второй с кольцевой структурой останется единственная линейная, то есть формируется моносомия — генетическая аномалия изменения кариотипа (совокупности признаков полного набора хромосом). Подобная ситуация для организма даже более фатальна, чем наличие кольцевой хромосомы. Ученые начали наблюдать за моносомиями и пришли к выводу, что клетка нормализуется, самостоятельно удваивает оставшийся гомолог, восстанавливая естественное число копий хромосом, но они при этом становятся линейными, то есть организм способен исправлять свой кариотип. Подобное явление специалисты регистрировали на примере 13-й и 17-й хромосом, однако насколько оно универсально, как зависит от происхождения кольцевой хромосомы, ее размера и структуры, было неизвестно. Поэтому сибирские ученые решили попробовать запустить обратный процесс — хромосому с мутацией замкнуть в кольцо, выбросить это кольцо из стволовой клетки, дождаться удвоения оставшейся линейной хромосомы, то есть нормализовать кариотип, и получить для пациента клетку со сбалансированным хромосомным набором без наследственной мутации. «По сути своей, мы преследовали призрачную цель генной терапии в формате модификации крупных хромосомных перестроек. Наш коллектив не просто изучает клетки в пробирке, мы их возвращаем в эмбриональное состояние и, инициируя их дальнейшее размножение и специализацию, можем проследить, сохраняется ли мутация или нет. Так, например, при проведении диагностики у пациента, взяв для исследования образец его крови, можно диагностировать хромосомную аномалию. Однако в случае нестабильных хромосомных перестроек невозможно провести аналогичную диагностическую процедуру, например, в клетках мозга, в которых спектр мутаций может оказаться совсем иным. Именно с этим ограничением связаны основные вопросы, каким образом та или иная мутация влияет на конкретный орган и на жизнеспособность всего организма в целом. Однако, вернув клетки с некоторыми допущениями в эмбриональное состояние, реально впоследствии получить нейрон с такой же перестройкой, после чего у нас есть возможность понять, как в этом нейроне работают другие гены, затронутые хромосомной перестройкой, в сравнении с клеткой с нормальным хромосомным набором», — добавляет Игорь Лебедев.
В комплексной работе по изучению хромосомной нестабильности участвуют несколько групп ученых из разных научных организаций — клиническая и диагностическая роль отводится специалистам Томского НИМЦ, а все исследования, связанные с получением и дифференцировкой индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, — в компетенции сотрудников ФИЦ «Институт цитологии и генетики СО РАН».
Можно использовать клетки крови, но здесь есть свои тонкости: обычно они состоят в основном из эритроцитов, у которых ядра уже выброшены, в свете чего требуется ядерное обогащение элементами крови. Поэтому эксперименты проводятся с фибробластами кожи — эти клетки способны делиться достаточно долго, подобный материал доступнее и можно хранить его с запасом на случай дополнительных экспериментов. После получения биоматериала начинается этап перепрограммирования: берутся фибробласты кожи и в них интегрируются определенные транскрипционные факторы, так называемый коктейль Яманаки, которые активно работают и запускают формирование индуцированных стволовых клеток с плюрипотентным состоянием. «Встраивание фрагмента ДНК осуществляется при помощи электропоратора, то есть для интегрирования факторов в ядро нужно воздействовать на него электрическим зарядом, после чего плазмиды проникают в клетку, и происходит процесс перепрограммирования. Первые дни фибробласты ничем не отличаются, но примерно через две недели из определенной их доли мы уже получаем так называемые индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, из которых дальше ведем индивидуальные клеточные линии. Весь процесс занимает примерно 18—20 дней (необходимо время, чтобы клетки несколько раз поделились). После всего этого проводится анализ для подтверждения плюрипотентности, определяется соответствие типичному портрету (например, имеется ли характерный набор белков). Полученная в итоге клеточная линия является инструментом для проведения исследований, частным вариантом для каждой хромосомы. Проделанная в соответствии с международными стандартами работа вносится в европейскую базу данных по стволовым клеткам, и в дальнейшем другие ученые могут использовать наши клеточные линии», — говорит научный сотрудник сектора геномных механизмов онтогенеза ФИЦ ИЦиГ СО РАН кандидат биологических наук Анна Александровна Хабарова.
Таким образом, кольцевые хромосомы неожиданно оказались удобным модельным объектом для изучения нестабильности хромосомного набора человека и возможности его коррекции. «В своем развитии современная генетика приблизилась к возможности коррекции генных нарушений, однако на данный момент на работы по генетической модификации эмбрионов человека на ранних этапах развития введен мораторий. Пока что неизвестно, как внесенные изменения проявятся в будущем (в том числе в следующих поколениях), какие процессы будут затронуты вследствие исправления мутации — это неведомая область знаний. Поэтому наш коллектив отчасти пытается понять и прогнозировать влияние вносимых изменений на судьбу клеток. Мы в лабораторных условиях наблюдаем весь спектр изменчивости генетической мутации, когда она проходит через стадию раннего эмбрионального развития. Пока еще неясно, насколько моделирование в искусственных системах приближено к реальному организму, однако исследование уже имеет свою значимость. Главным итогом является то, что мы оценили, как себя ведут нестабильные хромосомные мутации в плюрипотентном состоянии, и то, что в ряде случаев происходят события, приводящие к устранению мутантных клеток из организма и в конечном итоге к нормализации хромосомного набора», — добавляет Игорь Лебедев.
Андрей Фурцев
Фото предоставлено исследователями
Информация предоставлена Управлением по пропаганде и популяризации научных достижений СО РАН
