Увидеть то, что скрыто

Открытие флуоресцентных белков позволило ученым следить за клеточными процессами в живых системах. О свойствах флуоресцентных белков и сфере их применения наш разговор с  членом-корреспондентом РАН, доктором биологических наук Константином Лукьяновым.

- Вы работаете с флуоресцентными белками. Расскажите, что это за белки и в какой сфере они применяются?

- Первые флуоресцентные белки были обнаружены у медуз, а затем у других морских организмов – коралловых полипов, небольших рачков и других подводных обитателей. Главное свойство флуоресцентных белков состоит в том, что единственный ген флуоресцентного белка, вставленный в другой организм – в бактерию, в линию клеток, в трансгенную мышь, лягушку и т.д. – позволяет проводить мечение этого организма. И далее организм, живая система использует этот генетический материал и своими собственными клетками вырабатывает флуоресцентный белок, фактически, сама себя метит.

То есть в отличие от других пигментов, которые известны ученым, в случае с флуоресцентным белком достаточно одного гена для проявления флуоресцентных свойств. Это удобно для биологов и биотехнологов, поскольку это простой способ сделать организм или клетку флуоресцентными.

- А какова сфера применения флуоресцентных белков?

На основе флуоресцентных белков были созданы сенсоры для важных событий в клетке – изменение концентрации кальция, изменение мембранного потенциала, появление вторичных мессенджеров – циклических нуклеотидов, пероксида водорода и т.д.

Кроме того, белок GFP (зеленый флуоресцентный белок – анг. green fluorescent protein, GFP – прим. НР) можно присоединять к интересующему белку в клетке и наблюдать за тем, как он себя проявляет в живой клетке. До появления GFP ученые работали с антителами. Но для того, чтобы антитела окрасили клетку, ее нужно убить, иначе антитела просто не войдут внутрь. И у этого способа есть главный недостаток – отсутствие динамики, понимания того, как функционирует живая клетка и белки в ее составе.

В целом, флуоресцентные белки широко применяются на биологических моделях, где применим трансгенез – процесс введения генетического материала в живую систему. В медицине белки применяются только на этапах разработки лекарств и широкомасштабного скрининга, когда из сотен тысяч разных соединений нужно выбрать потенциально перспективные варианты.

- Над чем вы работаете?

- У флуоресцентного белка есть ряд параметров, которые делают его удобным для применения. Один из таких параметров, конечно, яркость – чем ярче белок, тем проще за ним наблюдать. Вторая важная характеристика флуоресцентного белка – фотостабильность, то есть устойчивость к химическим реакциям, приводящим к исчезновению флуоресцентного сигнала. Метки обесцвечиваются, это неизбежный процесс. При этом его можно минимизировать разными способами. Важно помнить, что флуоресцентные метки ведут себя по-разному – какие-то обесцвечиваются быстрее, какие-то живут дольше. Зная свойства фотообесцвечивания, понимая их, мы можем менять условия, чтобы дольше наблюдать флуоресцентные сигналы.

Также важно работать с множеством цветов. Чем больше у вас цветов, тем проще наблюдать за разными событиями в клетке или организме. Если вы в одной клетке следите за одним белком, а во второй клетке за другим белком, то вы не сможете понять, как они между собой «общаются». Важно увидеть взаимное расположение и взаимодействие этих белков в одной клетке. Для этого применяют многоцветное мечение – вы одновременно можете использовать, например, синие, зеленые и красные сигналы.

- Как в принтере?

- Да, верно. Вы можете воспользоваться одним цветом, но это не так весело и интересно. Чем больше цветов использует ученый, тем проще ему работать, поскольку он следит одновременно за двумя, тремя, четырьмя параметрами.

Существует и другое более сложное свойство флуоресцентных белков – фотоконверсия. Например, ученый, работая с зеленым белком в клетке, светит на него, превращая в красный. Это замечательно применяется в ситуациях, когда вы следите за одним объектом среди множества других. Скажем, вы наблюдаете за органеллами, фокусируете лазер на конкретную точку, которая из зеленой превращается в красную. Дальше вы следите за красным сигналом, наблюдаете за передвижением этой органеллы, и с чем она взаимодействует.

В последние годы появились методы сверхразрешающей флуоресцентной микроскопии, которые позволяют наблюдать за живыми системами с очень высоким пространственным разрешением.

- Как флуоресцентные белки применяются в изучении раковых опухолей? Их вводят в эмбрион или в живой организм?

- По-разному. Проще всего получить раковые клетки с флуоресцентным белком заранее, а потом подсадить их мышке. Тем самым, вы можете наблюдать за развитием опухоли. Плюс ко всему, можно поместить сенсоры в саму раковую клетку и наблюдать за различными биохимическими событиями в ней, например, индукцией клеточной гибели.

Существует процесс так называемого апоптоза – программируемой клеточной гибели, когда клетка распадается на отдельные апоптотические тельца. Эти частички поглощаются специальными клетками – макрофагами, защищающими организм от воспалительных реакций. Клетка сама «понимает», что ей нужно умереть и запускает необходимые процессы.

- Как она это «понимает»?

- В организме заложен механизм, отвечающий за то, чтобы клетки погибали. Поломка таких механизмов часто приводит к раковой опухоли, поскольку клетка не хочет умирать и продолжает расти и мутировать.

Со временем организм отказывается от части клеток, которые ему больше не нужны. Например, пальцы на нашей руке – это тоже результат апоптоза. Всё, что было между пальцами у зародыша отмирает.

Когда клетка подвергается химическому, вирусному, любому другому воздействию, она понимает, что ей нужно умереть, чтобы не подвергать риску весь организм. Это сложный, многоступенчатый процесс, который мы можем использовать. Скажем, установить сенсор, который будет сигнализировать о том или ином этапе умирания клетки. С помощью сенсора можно за несколько часов до гибели клетки проследить за этим процессом на разных этапах. Это часто используют в скрининге при разработке лекарств, которые запускают механизм программируемого умирания клеток.

Ученые разрабатывают разные модели, в том числе с использованием флуоресцентных сенсоров, чтобы отследить ответ опухоли на лечение. Почему то или иное лекарство подействовало или не подействовало. Опухоль ужасно «хитрая». И если ты понял, как ей удалось избежать гибели от лечения, то ты имеешь шанс придумать новое лекарство.