Человек с давних пор мечтал познать окружающий его, но невидимый невооруженным глазом мир. Попытки создания первого микроскопа предпринимались еще на рубеже XVI—XVII вв. Сам великий Галилео Галилей в 1612 г. конструирует устройство под названием occhiolino («маленький глаз»). Но, пожалуй, прорывом в микромир мы обязаны Антони ван Левенгуку, который изобрел самый простой и удобный в обращении оптический микроскоп. Современные приборы слабо напоминают этот знакомый всем со школьных времен микроскоп. Некоторые из них могут занимать целую комнату, но и по своим возможностям они позволяют буквально «разложить на атомы» любой объект.
О том, зачем нам все это нужно, какие перспективы открывает и какие прорывы готовит современная микроскопия, рассказывают ученые из НИЦ «Курчатовский институт».
Алексей Валерьевич Овчаров, исполняющий обязанности руководителя ресурсного центра зондовой и электронной микроскопии «Нанозонд» отдела ресурсных центров Курчатовского комплекса НБИКС-природоподобных технологий:
Все началось с того, что в 2009 г. по инициативе М.В. Ковальчука была создана лаборатория электронной микроскопии. С течением времени лаборатория перешла в состав отдела ресурсных центров. Мы проводим совместные исследования с различными российскими институтами, но основное направление наших работ — внутренние проекты нашего центра. Например. в Курчатовском институте большое количество лабораторий, которые занимаются разработкой и синтезом разного рода материалов. Когда встает вопрос о микроструктуре и составе полученных материалов или, например, коллеги хотят визуализировать рост клеток на матриксах, они обращаются к нам.
Для этого нужно какое-то особенное приближение?
Да. С помощью оптической микроскопии мы это не увидим, а электронная микроскопия дает возможность изучить структуру исследуемых объектов вплоть до атомарных размеров.
Какие задачи перед вами стоят?
Перед нами огромное количество задач. Всю электронную микроскопию можно разделить на два направления: материаловедение и ряд биологических задач, то есть наука о живом. В материаловедении для нас сейчас актуальны такие проблемы, как исследование сверхпроводников, различных металлов, элементов наноэлектроники, спинтроники, керамики и геологических образцов. Мы изучаем также объекты культурного наследия, о которых с помощью современных методов электронной микроскопии можно получить новые, ранее неизвестные данные. В науке о живом у нас есть несколько обширных классов задач: определение трехмерной структуры макромолекул, вопросы клеточной биологии и медицины. Потенциал изучения таких объектов огромен.
Мы сейчас наблюдали, как один из ваших сотрудников работает с криоматериалами. Фантастическое зрелище. Расскажите, что он делает.
Чтобы работать с биологическими объектами, их нужно подготовить специальным образом. Для этого объект нужно заморозить, причем так, чтобы за счет сверхбыстрого охлаждения образовался аморфный водяной лед, который не будет давать контрастного фона во время исследований. Вы видели, как Р.А. Камышинский выполняет эту процедуру, называемую витрификацией образца. Она нужна для того, чтобы сохранить исходную или естественную структуру исследуемого объекта, в данном случае клеток. После этого мы сможем подготовить с использованием фокусированного ионного пучка в криогенном режиме тонкую пластинку— ламель— для дальнейшего изучения с помощью просвечивающей криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ).
Допустим, он получил такую структуру. Что дальше?
Если в материаловедении мы можем видеть непосредственно атомные колонки в образце нового сплава или кристалла, то в крио-ЭМ на объект нельзя воздействовать большим потоком электронов, поэтому приходится работать в режиме низких доз и получаются крайне «шумные» изображения с низким контрастом. Один из способов решения этой проблемы— применение метода анализа одиночных частиц, который подразумевает использование набора из сотен тысяч, а иногда и миллионов проекций молекул (рибосом, вирусов, белков) во льду, находящихся в разных ориентациях, и потом с помощью высокопроизводительных вычислений мы сможем восстановить трехмерную структуру, а затем вписать в нее атомную модель. Проблема здесь не столько в том. чтобы получить крио-ЭМ-изображения, сколько в том, чтобы правильно их обработать; это длительный и трудоемкий процесс, который иногда занимает недели, иногда месяцы даже с использованием ресурсов суперкомпьютера Курчатовского института.
У обывателей может возникнуть вопрос: зачем ученым все это нужно? Зачем рассматривать объекты, если это настолько долго и трудно? Что это дает?
Возьмем конкретный пример: допустим. у нас есть рибосома с антибиотиком. Как работают антибиотики? Мы все их иногда принимаем, но как они действуют, мало кто знает. Для многих антибиотиков какие-либо структурные данные и вовсе отсутствуют. С помощью крио-ЭМ мы можем определить молекулярный механизм работы антибиотика, структурные перестройки, возникающие в рибосоме при связывании с ним. Почему это интересно? Понимание механизма действия антибиотика на бактериальную рибосому способствует разработке новых лекарств, что особенно актуально в связи с развитием резистентности к ним патогенов. Не сегодня завтра мы можем столкнуться с тем, что появятся патогены, с которыми мы не сможем бороться. Это проблема номер один, и нам необходимо искать пути ее решения уже сейчас. Например, в случае рибосомы с антибиотиком диритромицином мы получили разрешение выше 2,1 ангстрема. Мы первыми в мире смогли получить структуру рибосомы с таким высоким разрешением. Данная работа ведется совместно с отделением молекулярной и радиационной биофизики НИЦ «Курчатовский институт» — ПИЯФ в Гатчине.
Вы сказали, что работаете с вирусами. С какими конкретно?
Не совсем так. Чтобы работать с действительно опасными вирусами в их естественном состоянии, нужно иметь специально подготовленную лабораторию с необходимым уровнем биологической защиты. В России такая лаборатория находится в Новосибирске — это всем известный «Вектор». Мы можем работать лишь с абсолютно безопасными частями вируса, например с белками, формирующими капсид, либо с так называемыми инактивированными вирусами, фактически вакцинами. У нас был проект по исследованию перспективной вакцины против гриппа. В настоящее время совместно с отделом структурной биологии комплекса ведутся работы по изучению структуры инактивированного вируса клещевого энцефалита.
Что нового о гриппе вы узнали?
Работа заключалась в том, чтобы получить структуру перспективной вакцины. Нам успешно это удалось, причем с разрешением, ранее доступным только для рентгеноструктурного анализа.
А исследованием коронавируса вы не занимались?
К настоящему моменту мы не проводили исследований коронавируса, хотя все технические возможности у нас для этого имеются. В перспективе мы могли бы заняться работой с инактивированными образцами.
Что представляет собой ваше оборудование, насколько оно уникально?
В нашем ресурсном центре представлен единственный в России криогенный электронный микроскоп, позволяющий получать структуры биологических макромолекул с высоким разрешением. В мире всего несколько сотен аналогичных приборов, но каждый электронный микроскоп по-своему неповторим. У микроскопа всегда есть некий набор основных узлов, электронная пушка, оптическая система, но каждая лаборатория индивидуально выбирает для решения своих задач конкретный набор аналитического оборудования, разнообразные детекторы и спектрометры. Конкретно наш микроскоп позволяет исследовать биологические объекты в нативном состоянии, в частности с помощью вышеупомянутого метода анализа одиночных частиц. Для решения задач клеточной биологии применяется комплементарный метод—криоэлектронная томография. Несмотря на более низкое пространственное разрешение, метод позволяет получить исключительно ценную информацию об ультраструктуре клеток и взаимном расположении молекулярных структур. Одна из последних работ, выполненных в нашем ресурсном центре совместно с отделом биотехнологий и биоэнергетики, посвящена исследованию структурных особенностей митохондриальных комплексов.
Если говорить о микроскопии для решения задач материаловедения, то ключевые направления исследований — изучение перспективных материалов спинтроники и наноэлектроники, различных сверхпроводников. включая традиционные, но очень важные для создания термоядерного реактора. Перед нами открывается новый, удивительный наномир, где царят свои законы, проявляется своя физика. К нам обращаются подразделения, которым интересно посмотреть, как на атомарном уровне происходит послойный рост, например, пленок для спинтроники. Казалось бы. два одинаковых образца, но электрофизические характеристики различаются, причем иногда в разы, и нам надо ответить на вопрос, с чем это связано.
В чем же отличия?
С точки зрения атомной структуры вещества электронная микроскопия позволяет визуализировать дефекты, которые нельзя наблюдать другими методами. Бывает, из-за разности в параметрах атомной решетки накапливаются напряжения. которые должны куда-то уходить. Мы можем увидеть, например, образование дислокаций и. в частности, визуализировать ядро дислокации. Кроме того, бывают такие задачи, когда нужно понять, почему добавки конкретного элемента оказывают сильное влияние на свойства материала. Бывает, что научные сотрудники выполняют проект, для которого необходимо понимание микроструктуры на атомном уровне. Мы — то подразделение, которое это понимание реализует. В частности, электронная микроскопия легко дает ответы на вопросы о концентрации того или иного элемента или группы элементов. С помощью аналитических методов можно определить тип соединения, выявить, находится ли оно в исходном состоянии или с чем-то соединилось и образовало новые вещества.
Насколько важно то, что вы находитесь внутри Курчатовского института?
Безусловно, расположение в Курчатовском институте имеет ряд неоспоримых преимуществ, связанных прежде всего с развитой инфраструктурой и возможностью взаимодействия с другими подразделениями центра, что позволяет обеспечить непрерывность и полноту проводимых исследований. В частности, здесь же находится Курчатовский синхротрон — уникальная научная установка класса «мегасайенс», единственный специализированный источник синхротронного излучения на всем постсоветском пространстве. В этом плане Курчатовский центр представляет собой уникальный научный организм, в котором есть все необходимое для решения подобных задач.
Сформулированы ли конкретные планы на ближайшее будущее?
Сейчас мы ведем несколько крупных научно-исследовательских работ с ведущими российскими институтами по структурной биологии — это та область, в которой очень высок интерес к электронной микроскопии, поскольку она позволяет исследовать живые системы в ранее недосягаемых масштабах. Целый ряд перспективных мишеней для лекарственных препаратов — это белки, кристаллизация которых затруднена или невозможна, что существенно ограничивает их исследование классическими методами. А крио-ЭМ позволяет определить их структуру с разрешением не хуже, чем у рентгеноструктурного анализа. То же самое и в материаловедении. Это исследования в области металлов, используемых в реакторах, сверхпроводники, материалы наноэлектроники. В коротком интервью все не перечислить.
Ученые каких специальностей здесь работают?
В основном это наши же воспитанники из Московского физико-технического института, с факультета ИНБИКСТ, для которого Курчатовский институт выступает базовой кафедрой. У нас работают также выпускники других ведущих российских вузов.
У нас есть работа как для физиков, так и для химиков и биологов. С момента появления криоэлектронного микроскопа для биологических исследований нам нужны кадры, которые не только разбираются в электронной микроскопии и понимают физику процесса, но и хорошо ориентируются в биологии и химии. Я сам физик-материаловед, окончил магистратуру МФТИ по направлению «Прикладные математика и физика», занимаюсь сверхпроводимостью.
В Курчатовском институте есть своя пилотная линия по производству сверхпроводящих лент, и мы активно с ними сотрудничаем. Одна из задач ресурсного центра— осуществление контроля качества выпускаемых лент. Сейчас перед Россией стоит задача использовать для производства сверхпроводящих лент полностью российские исходные материалы, в том числе мишени для осаждения сверхпроводников. Мы изучаем, насколько подходят российские мишени для получения сверхпроводящих лент. Провода показывают хорошие электрофизические характеристики, и от мирового уровня мы не отстаем, хотя для нас это нечто новое и мы никогда раньше ничего подобного не создавали.
Вы думаете, что со временем мы сможем все это делать сами?
Мы стараемся, прикладываем максимальные усилия. Но. конечно, сталкиваемся с определенными проблемами. Все микроскопы в ресурсном центре зарубежного производства. Микроскоп — это. по сути, нанолаборатория, технически очень сложное устройство. Надо понимать, что если в нем что-то выходит из строя, то нам приходится обращаться к зарубежным коллегам. благо, у нас налажены связи с целым рядом ведущих специалистов в электронной микроскопии и инженеров, в основном наших соотечественников, которые работают за границей. Для мирового научного сообщества очень важно объединить усилия для достижения передовых результатов.
Александр Александрович Никитин, старший научный сотрудник лаборатории атомномасштабных и ядерно-физических методов исследования НИЦ «Курчатовский институт>> — ИТЭФ:
Изначально наша лаборатория развивалась вокруг исследования реакторных материалов для ядерной техники. Это сравнительно новая инструментальная методика. получившая свое развитие в 1990-хгг., и здесь мы используем определенный вид микроскопии. Если говорить простыми словами, то это поатомная разборка материала. Наш микроскоп позволяет контролируемо отрывать отдельные атомы от образца. регистрировать химическую природу этих атомов и местоположение, откуда они были сняты.
Как называется ваш микроскоп?
Это атомно-зондовый томограф. Атомный — потому что мы отделяем отдельные атомы. Зондовый— потому что сам атом, который отделяется, служит зондом. Он прилетает на наш детектор, дает сигнал регистрации, и мы фиксируем его местоположение и химическую природу. А томограф— потому что итогом эксперимента становится томография разобранного материала. Здесь можно провести аналогию с компьютерной томографией, которую вам делают в поликлинике. Вы получаете информацию об исследованном образце в виде его срезов, трехмерных изображений — атомных карт, содержащих информацию о том, где и в какой позиции располагаются отдельные атомы в данном материале.
Для чего вы это делаете? Что это дает?
Наш микроскоп служит для разных задач. Первая — контроль качества материала. Сейчас, когда промышленность нацелена на создание так называемых наноструктурированных материалов, где свойства определяются тонкой структурой, это особенно важно. Зачастую данная структура состоит из хитро заданного технологом расположения отдельных атомов в материале. Непосредственно после создания такого материала, когда он выходит с конвейера, требуется проконтролировать его качество. Это крайне важно, поскольку от этого может зависеть безопасная работа сложнейшего технологического устройства, а в конечном счете — наша с вами. На данном этапе наш микроскоп позволяет провести ту самую поатомную разборку и дать технологу обратную связь, чтобы понять, создан ли этот материал согласно его задумке или что-то пошло не так; действительно ли материал будет выполнять свои технологические задачи и располагать нужными характеристиками.
Кроме того, одно из дополнительных направлений, в рамках которых мы проводим исследования, — это анализ различных тонких воздействий на материал. В частности, мы исследуем воздействие ионизирующих излучений на структуру и свойства материалов. Эффекты, которые происходят в материале при соударении отдельных ионов или. допустим, нейтронов с его структурой, достаточно тонкие. Они тоже происходят на уровне отдельных атомов. И чтобы проследить, проконтролировать эти изменения, понять, как эти процессы происходят, также необходима поатомная разборка. Наш микроскоп предоставляет информацию о материале до воздействий и после. Затем мы проводим сравнительный анализ и определяем, какие элементы в данном процессе играют ключевую роль.
Я слышала, что этот микроскоп уникален. В чем его особость?
Этот микроскоп уникален для нашей страны. До появления таких приборов поатомная разборка материала представлялась невозможной. Конечно, были другие методики, которые давали и качественную, и количественную информацию, но именно на таких масштабах взаимодействия отдельных атомов информации еще не было. Как раз в этом и заключается беспрецедентность нашего микроскопа. В России таких микроскопов три, и все они находятся в Курчатовском институте. Первые два имеют импортное происхождение, а наш микроскоп самой последней по времени сборки 2015 г. разработан у нас. Когда мы поняли, что французский микроскоп 2003 г. уже не справляется со всеми задачами, запустили собственный проект по созданию установки. Сейчас мы ее эксплуатируем как нашу основную «рабочую лошадку». По своим техническим характеристикам наш микроскоп соответствует уровню современных передовых зарубежных аналогов, нисколько им не уступая.
Наверное, непростая была работа?
Работа была достаточно сложной. Сначала надо было спроектировать железную часть установки, потом программное обеспечение, потому что сам по себе аппарат без машинного управления ничего собой не представляет. Нужно понимание логики управления самой установкой и проведения исследования, то есть сбора так называемых сырых данных, а затем их переработки в атомные карты. Требуется также математический аппарат для анализа этих данных. В очень маленьком кусочке материала заложено очень большое количество атомов — их там многие миллиарды. Так вот, тот объем, который мы собираем в процессе исследования, — это несколько десятков миллионов атомов. Иначе говоря, наша томограмма, тот трехмерный объем, который мы исследуем, состоит из нескольких десятков миллионов точек, объектов. Это достаточно большой массив данных, который несет в себе информацию не только о расположении атомов. их координатах и трехмерном пространстве, но и об их химической природе, плюс еще техническую информацию, которая собирается с установки. Поэтому получается колоссальный многомерный массив. с которым требуется работать. А для этого нужны определенные алгоритмы и быстрые вычислительные машины. Поскольку история проектирования и сбора установки начиналась в достаточно сложных условиях, как финансовых, так и организационных, это стало небольшой «войной», номы через нее прошли и сегодня имеем очень хороший результат. На текущий момент у нас есть инструмент, который позволяет нам проводить исследования на мировом уровне.
Что для вас удивительного, нового открыл наномир, который вы увидели? Что он собой представляет?
Я занимаюсь этой тематикой довольно давно, еще со студенческой скамьи, но для меня по сей день удивительно, как работает этот аппарат. Мы еще со школы имеем представление, что такое микроскопия, мы знаем также, что мир состоит из атомов — кубиков мироздания. Но наше сознание устроено так, что пока сам не увидишь, не поверишь. Наша установка позволяет буквально вручную разобрать материал по атомам. Для меня каждый раз это удивительно. Воспринимаю это как некую магию. Мы вроде бы понимаем, что материалы вокруг нас как-то образуются, формируются, создаются, но мы всегда работаем с какими-то макрообъектами. А здесь мы берем этот макрообъект и его маленькую частичку и делаем то, что называется «обратный инжиниринг», — это когда вы разбираете что-либо, пытаясь понять, как оно устроено. Мы делаем обратный инжиниринг веществ, которые нас окружают, то есть фактически окружающего нас мира. Разве это не чудо?
Сергей Васильевич Рогожкин, доктор физико-математических наук, начальник отдела атомно-масштабных исследований материалов ядерной техники НИЦ «Курчатовский институт» — ИТЭФ:
Наши атомно-зондовые томографы, на которых мы сегодня работаем, позволяют выявить в материалах то, что практически недоступно для других методов. Наши самые первые исследования были посвящены конструкционным материалам реакторов. Уже тогда было показано, что радиационные изменения наноструктуры, которые возникают в этих материалах, критически важны с точки зрения деградации элементов реакторных установок. Двигаясь дальше, мы всякий раз находили что-то принципиально отличающееся от общепринятых взглядов и позволяющее нам предсказать, что будет с материалом при больших дозах нагрузок или больших временах эксплуатации. Все это подтверждалось в течение долгих лет.
Эти установки интересны не только для реакторного материаловедения, но и для многих других направлений. Это и наноэлектроника, и новые биоматериалы, полимерные материалы: ведь эта методика позволяет в атомных масштабах проанализировать, что собой представляет материал, а точнее — как он должен выглядеть на атомарном уровне, каким должен быть с точки зрения его свойств и как добиться такого результата. Мы занимаемся не только эксплуатацией таких установок, но и их разработкой. Сейчас мы создаем прототип установки следующего поколения, в ближайшее время она будет запущена. Таким образом, мы выйдем на создание промышленного прибора, который востребован в научных и материаловедческих организациях России, а также в ряде зарубежных стран, где таких установок мало или совсем нет.
Андрей Аскольдович Алеев, научный сотрудник НИЦ «Курчатовский институту — ИТЭФ:
Ключевая задача, которой занимаемся я и мои коллеги, — разработка томографического микроскопа и развитие микроскопии как направления. Здесь используются передовые технологии с точки зрения как сбора и обработки информации, так и инженерии — условий, при которых происходит исследование материалов: это сверхвысокий вакуум— 1010торр, сверхнизкие температуры — ниже температуры кипения жидкого азота, сверхкороткие импульсы лазерного излучения — сотни фемтосекунд, в совокупности обеспечивающие атомарное разрешение и изотопную чувствительность на всем спектре периодической таблицы. Микроскоп позволяет приоткрыть завесу того, как устроен материал, как расположены в нем атомы, какие они, как выглядит их взаимное расположение.
Наша непосредственная цель — с одной стороны, повысить качество того, что этот подход может дать, то есть улучшить алгоритмы обработки информации и внедрить передовые решения, методики в области сбора данных; с другой стороны, мы пытаемся расширить область применения, например, скрестив этот микроскоп с другим— сканирующим электронным микроскопом (СЭМ) с двухлучевой системой. В одном микроскопе — СЭМ — исследуется материал на больших масштабах, происходят выявление областей, интересных для исследования, и приготовление образцов, для чего используется, например, сфокусированный ионный пучок, а в соседней атомно-зондовой приставке осуществляется непосредственное детальное исследование интересующей области. Такая комбинация нужна для того, чтобы не вытаскивать образец на воздух, где неизбежно происходит окисление поверхности и, как следствие, насыщение азотом, водородом и водой. Наша задача — избежать этого и сделать приставку к СЭМ в виде атомно-зондового томографа, чтобы передача образца происходила непосредственно из камеры предварительного исследования и пробоподготовки в камеру, где происходит само исследование.
Такая близость двух микроскопов дает еще и ряд других преимуществ. Например. какие-то повреждения или искажения. связанные с перемещениями образца. также будут минимизированы. Кроме того, нам открывается целый класс задач. когда, например, образец можно захолаживать и переносить в замороженном виде. В мире есть работы, когда исследуются замороженные биологические материалы. что позволяет сократить как время. так и вероятность того, что при транспортировке образец будет поврежден или разморожен. Все это весьма перспективно и интересно.
Когда разрабатываешь новый прибор или его другую модификацию, это всегда шаг в неизвестность, открытие чего-то нового. Ты обнаруживаешь те или иные закономерности. которые вроде бы описаны в учебниках, но когда ты их реализуешь в приборе, они претерпевают существенные изменения. В результате простые формулы, известные с вузовской скамьи, как
выясняется, не работают. Оказывается, мир значительно сложнее и интереснее, чем все то, что можно описать теоретически. Тут требуется эмпирико-теоретический подход — соединение двух направлений, часто противоречащих друг другу.
Одно из таких последних наших открытий связано с фемтосекундным лазером. Первоначально пучок его импульса составлял порядка 60 фс. Считалось, что это необходимое условие для того, чтобы исследование было эффективным. Но в какой-то момент мы поняли, что изменение длительности — скажем, не 60 фс, а 300 фс — ничего не меняет. Это значительно упростило подготовку и проведение самого исследования, увеличило надежность и уменьшило стоимость оборудования в части, связанной со сжатием лазерного импульса и его наведением.
Сейчас мы работаем над тем, чтобы проверить гипотезу, можно ли использовать не фемтосекундные, а пикосекундные лазеры. У них более длительный импульс лазерного излучения. Оборудование уже в монтаже. Вполне возможно, что это сработает, и если да, то мы в разы упростим сам процесс исследования, а также существенно удешевим установку, значительно повысив ее компактность. Хотелось бы сделать что-то более миниатюрное, что можно если не в карман положить, то уж точно поставить на лабораторный стол.
■
Беседовала Наталия Лескова
