Ученые НИЦ «Курчатовский институт» совместно с российскими и зарубежными коллегами создали новый индикатор для визуализации процессов, происходящих в нейронах головного мозга. Он был получен методами генной инженерии и стал одним из самых ярких белковых индикаторов кальция, разработанных на данный момент. Благодаря своей чувствительности к изменениям внутриклеточной концентрации кальция он позволяет наблюдать за передачей нервного импульса. Результаты этой работы опубликованы в журнале International Journal of Molecular Science.
Генетически кодируемые кальциевые индикаторы представляют собой белки, состоящие из двух частей. Белок-сенсор «чувствует», как меняется концентрация кальция, а флуоресцентный белок «интерпретирует» эти данные в сигнал. Большинство разработанных ранее кальциевых индикаторов были основаны на флуоресцентном белке eGFP.
«Уникальность нашей работы состоит в том, что для создания нового кальциевого индикатора в качестве флуоресцентной части был использован не eGFP, а другой белок – mNeonGreen. На данный момент он является одним из самых ярких флуоресцентных белков в области зеленого спектра. Его использование обеспечило нашему индикатору рекордную яркость, которая почти в полтора раза выше, чем у аналогов на основе eGFP», – отметила инженер-исследователь ресурсного центра молекулярной и клеточной биологии Курчатовского комплекса НБИКС-природоподобных технологий Алена Николаева. Она добавила, что mNeonGreen является производным белка, первоначально выделенного из европейского ланцетника – низшего хордового животного.
Новый индикатор получил название NCaMP. Его ген был введен в геном бактерии E. coli для наработки рекомбинантного белка. После оптимизации несколькими раундами направленной эволюции была получена библиотека, состоящая из различных вариантов NCaMP, отличающихся по биохимическими характеристиками. Ученые остановили свой выбор на наиболее подходящей версии – NCaMP7.
Дальнейшие эксперименты на нейрональных культурах позволили определить локализацию индикатора в клетках и оценить, как быстро он реагирует на изменение внутриклеточной концентрации кальция. Доказав эффективность использования NCaMP7 на нейрональных культурах, ученые перешли к экспериментам на животных. На этом этапе были задействованы современные методы высокоскоростной двухфотонной микроскопии, позволяющие наблюдать за процессами в живых тканях. Полученные данные подтвердили применимость нового индикатора для визуализации активности нейронов коры головного мозга мышат. Любопытно, что белок низшего хордового животного оказался полезен для изучения сложнейших процессов передачи нервного импульса у млекопитающих.
«Осуществление такого масштабного мультидисциплинарного проекта стало возможным благодаря совместной работе экспертов из самых разных областей науки. В нем участвовали молекулярные биологи, биохимики, клеточные биологи, специалисты по рентгеновской кристаллографии и генной инженерии. Именно это объясняет обширность и глубину полученных результатов», – подчеркнула Алена Николаева.
